Zdolność bakterii probiotycznych do adhezji nabłonka – badania in vitro

Zdolność adhezyjna mikroorganizmów probiotycznych do komórek nabłonka jelitowego jest jedną z kluczowych cech drobnoustrojów wymaganą do ich późniejszego prozdrowotnego działania na organizm człowieka. Umożliwia ona bezpośredni kontakt bakterii probiotycznych z komórkami gospodarza, a także wydłuża czas ich przebywania w układzie pokarmowym. Dlatego też, obok badań nad wrażliwością na wpływ niskiego pH czy obecność soli żółciowych oraz enzymów trawiennych, jest to jeden z podstawowych wykładników efektywności działania preparatów probiotycznych.

Metodyka

Oprócz produktów probiotycznych do badań wykorzystano linię komórek CaCo-2 wyizolowanych z ludzkich komórek nowotworu okrężnicy oraz linię HT-29 z gruczolakoraka jelita grubego. Obie linie komórek pochodziły z Amerykańskiej Kolekcji Kultur Komórkowych (ATCC). Komórki nabłonka jelitowego CaCo-2 i HT-29 hodowano w pożywce DMEM, zawierającej dodatek niezbędnych aminokwasów i gentamycynę.

W pierwszej kolejności pobrano odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej stanowiącej produkt probiotyczny, zawierający 6,0×10⁸ jtk/ml bakterii. Całość uzupełniono pożywką DMEM i antybiotykiem. Hodowlę komórek CaCo-2 i HT-29 prowadzono w inkubatorze w temperaturze 37°C i atmosferze gazowej zawierającej 4% CO₂ i 96% powietrza, dokonując wymiany pożywki co 24 h.

Hodowlę prowadzono przez 21 dni dla kultury CaCo-2 i 14 dni dla kultury HT-29. Liczbę komórek CaCo-2 i HT-29 oznaczano pod mikroskopem. Przed wykonaniem testu, komórki CaCo-2 i HT-29 przemywano roztworem PBS i wprowadzano pożywkę DMEM zawierającą komórki bakterii probiotycznych. Hodowle inkubowano przez 2,5 h w temperaturze 37°C. Następnie do każdego dołka dodawano roztwór Triton X-100 i prowadzono lizę komórek CaCo-2 i HT-29. Lizaty przenoszono do probówek typu Eppendorff i wirowano. Supernatant usuwano, a osad zawieszano w soli fizjologicznej. Z wybranych rozcieńczeń wykonywano posiewy w trzech równoległych powtórzeniach. Hodowle prowadzono w pożywce MRS z 2% dodatkiem agaru w temperaturze 35°C przez 48-72 h.

Wyniki

Do oznaczenia właściwości adhezyjnych szczepów probiotycznych wchodzących w skład produktów probiotycznych wykorzystano 21-dniową hodowlę komórek CaCo-2 i 14-dniową hodowlę komórek nabłonka jelita grubego HT-29. Są to najczęściej stosowane modele komórkowe wykorzystywane do oznaczania zdolności adhezyjnych mikroorganizmów. Po zakończeniu pasażu jelitowego, oznaczono liczbę komórek bakteryjnych związanych z komórkami nabłonka jelitowego. Zdolność adhezyjną bakterii probiotycznych wyrażono jako poziom adhezji, czyli liczbę komórek mikroorganizmów związanych ze 100 komórkami linii CaCo-2 i HT-29.

Rysunki poniżej przedstawiają wyniki zdolności adhezyjnej drobnoustrojów probiotycznych wchodzących w skład produktu po procesie trawienia w jelicie cienkim. Uzyskane wyniki wskazują największe powinowactwo do komórek nabłonka preparatu bakteryjnego z dodatkiem matrycy żywnościowej w postaci mleka zastępczego.

Liczba bakterii związanych ze 100 komórkami nabłonka jelitowego wynosiła odpowiednio dla CaCo-2 258 i dla HT-29 409. Najmniejszą związaną liczbę komórek, tak samo jak w przypadku analizy prowadzonej z wykorzystaniem komórek linii CaCo-2, zaobserwowano dla produktu bez zastosowania matrycy żywnościowej. W tym ostatnim wariancie w przeciwieństwie do innych (z wykorzystaniem matrycy żywnościowej) zarówno z wykorzystaniem linii CaCo-2, a także HT-29 liczba związanych komórek zmalała po inkubacji w warunkach imitujących proces trawienia w jelicie cienkim.

Porównując także liczbę bakterii związanych ze 100 komórkami CaCo-2 i HT-29 można stwierdzić, że komórki wchodzące w skład produktu probiotycznego mają większe powinowactwo do komórek linii HT-29. Zestawiając próby z największą liczbą komórek bakterii ulegających adhezji do komórek CaCo-2 i HT-29 zauważyć można, iż około 100 komórek więcej ulega procesowi adhezji z komórkami linii HT-29.

Rysunek 1. Liczba bakterii probiotycznych związanych ze 100 komórkami HT-29 oraz CaCo-2 po procesie trawienia in vitro

Te same wnioski wyciągnąć można z wyznaczonego na początku analiz procentowego stopnia adhezji, co przedstawia rysunek poniżej. Parametr ten opisuje wartość stosunku liczby komórek bakteryjnych, które uległy adhezji do liczby wszystkich wprowadzanych komórek. Uzyskane wyniki stopnia adhezji wskazują również, iż bakterie probiotyczne wchodzące w skład produktu posiadają wysoką zdolność przylegania do modelowych komórek nabłonka linii HT-29. Wartość ta uzależniona jest od zastosowanej w eksperymencie matrycy żywnościowej. Wyraźnie największą efektywność adhezji zauważyć można w próbie, którą wzbogacono matrycą żywnościową w postaci mleka zastępczego. Najmniejszy stopień adhezji do komórek HT-29 widoczny jest dla wariantu, w którym produkt był poddawany eksperymentom bez matrycy żywnościowej. Stopień adhezji komórek bakteryjnych do linii CaCo-2 utrzymuje się na niskim poziomie około 6% we wszystkich czterech badanych wariantach.R

Rysunek 2. Stopień adhezji niestrawionych bakterii probiotycznych przed pasażem jelitowym (%)

Wnioski

Najwyższy poziom adhezji drobnoustrojów z dodatkiem matrycy żywnościowej w postaci mleka w proszku jest związany z obecnością w tym produkcie szeregu substancji ochronnych. Jak już wspominano, mleko zastępcze jest bogate w wiele substancji o charakterze ochronnym w tym poliole, disacharydy, polisacharydy, aminokwasy, a także hydrolizaty białkowe, składniki mineralne, sole kwasów organicznych i wiele innych. W omawianej pracy najefektywniejszą ochronę właściwości adhezyjnych wykazało mleko zastępcze, gdzie liczba bakterii ulegających adhezji do komórek linii CaCo-2, a także HT-29 była największa.

Warto wspomnieć, że mleko jest powszechnie stosowaną substancją w celu ochrony przeżywalności oraz cech funkcjonalnych komórek bakteryjnych. Jest ono naturalnym środowiskiem dla bakterii fermentacji mlekowej, także ze względu na zawartość białek, licznych witamin i składników mineralnych, ale przede wszystkim laktozy będącej substratem dla tych drobnoustrojów. Zawarta w mleku laktoza, tworząc wiązania wodorowe z białkami błony komórkowej zwiększa także jej stabilność. Ponadto mleko dzięki pojemności buforowej zmniejsza kwaśny odczyn środowiska żołądkowego, przyczyniając się tym samym do obniżenia śmiertelności komórek bakterii probiotycznych w trakcie pasażu jelitowego.

Źródło: Badania nad oceną jakości i biofunkcjonalności produktów probiotycznych firmy Living Food Sp. z o.o.. Monografia Naukowa, 2019.